Le aree specialistiche del laboratorio di genetica

 
 
Nel laboratorio che si occupa di genetica le aree specialistiche si sono separate in relazione ai diversi approcci utilizzati per le analisi, approcci che si sono susseguiti nel tempo. Inizialmente lo studio delle alterazione genetiche in laboratorio è stato di tipo morfologico (citogenetica tradizionale), con la definizione delle alterazioni quantitative (del numero) e qualitative (della struttura così come evidenziabile al livello di risoluzione della microscopia ottica) dei cromosomi, gli organelli contenuti nel nucleo per i quali è stata per la prima volta effettuata l’associazione tra alterazioni cellulari ed ereditarietà. Con la FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) si è passati dalla citogenetica tradizionale alla citogenetica molecolare che, pur continuando a basarsi sulla microscopia ottica, ha consentito di individuare alterazioni cento volte più piccole. Infine con le tecniche di genetica molecolare oggi è possibile individuare alterazioni centomila volte più piccole di quelle individuabili medante la FISH. Essendo una singola lettera del linguaggio del DNA (base) l’unità elementare di informazione, analogamente a quanto avviene per una singola lettera dell’alfabeto, la citogenetica tradizionale è in grado di individuare (potere di risoluzione) alterazioni dell’ordine di grandezza di 10 Mb (Mb = megabasi = milioni di basi), la FISH  ha un potere di risoluzione di 100 kb (kb = kilobasi = migliaia di basi), mentre le tecniche molecolari più potenti (e che non sempre è necessario usare) hanno un potere di risoluzione che corrisponde ad una singola base.
 
 
  Citogenetica
 
 
Le citogenetica (il prefisso cito deriva dal greco kytos = "contenitore", e indica la cellula) studia l’assetto cromosomico delle cellule (cariotipo) In seguito a mutazioni il cariotipo può modificarsi nel numero o nella morfologia dei cromosomi che lo costituiscono, dando così origine alle anomalie numeriche dei cromosomi (aneuploidie) e alle anomalie strutturali dei cromosomi rispettivamente. Le anomalie cromosomiche, in base al periodo del ciclo vitale in cui si instaurano, sono distinte in anomalie cromosomiche costituzionali, riscontrabili in tutte le cellule di un individuo (corredo cromosomico omogeneo) o in una percentuale di esse (corredo cromosomico a mosaico) e anomalie cromosomiche acquisite (limitate ad un tessuto o ad una linea cellulare).
 
Anomalie numeriche dei cromosomi
 
Il numero cromosomico presente nei gameti (cellule germinali), che nella specie umana è di 23 e corrisponde alla metà del numero dei cromosomi presenti nelle cellule somatiche (46), viene definito aploide. Ogni cellula che contiene un numero di cromosomi diverso da un multiplo del corredo aploide viene definita aneuploide. Le aneuploidie più frequentemente osservate nell'uomo sono la monosomia (assenza di un elemento nella coppia di cromosomi omologhi) e la trisomia (presenza di un elemento addizionale in una coppia di cromosomi omologhi). In questi casi si parla di monosomia e trisomia completa, ma si possono verificare anche monosomie/trisomie parziali, per assenza o presenza in triplice copia di singoli segmenti cromosomici.
 
Le monosomie complete sono incompatibili con la vita postnatale, l'eccezione è rappresentata dalla monosomia del cromosoma X, associata alla sindrome di Turner. Le trisomie complete di alcuni cromosomi (trisomia 21 o sindrome di Down, trisomia 18 o sindrome di Edwards, trisomia 13 o sindrome di Patau) sono invece compatibili con la vita postnatale, come pure le aneuploidie dei cromosomi sessuali.
 
L'aneuploidia è causata, nella maggior parte dei casi, da errori di non-disgiunzione alla meiosi che causano la formazione di due cellule (gameti) che contengono rispettivamente un cromosoma in più ed uno in meno. La causa della non-disgiunzione non è nota, ma si verifica con maggior frequenza nella meiosi femminile ed aumenta con l'età. Da ciò deriva un aumentato rischio di patologia cromosomica fetale  in  madri di età superiore o uguale a 35 anni. La non-disgiunzione si può verificare anche durante la divisione mitotica, in tal caso si osserverà un cariotipo a mosaico per la presenza nello stesso individuo di cellule a corredo cromosomico diverso.
 
Le principali sindromi da aneuploidia sono:

Sindrome

Anomalia cromosomica

Frequenza alla nascita

Sindrome di Down

trisomia del cromosoma 21

1 :700

Sindrome di Edwards

trisomia del cromosoma 18

1: 6.000- 8.000

Sindrome di Patau

trisomia del cromosoma 13

1: 10.000

Sindrome di Klinefelter

costituzione dei cromosomi del sesso XXY

1: 1.000 maschi

Sindrome di Turner

monosomia del cromosoma X

1: 5.000 femmine

Anomalie strutturali dei cromosomi

Originano dalla rottura di uno o più cromosomi e, poichè queste rotture possono teoricamente avvenire ovunque nel genoma, il numero di potenziali riarrangiamenti è praticamente infinito. In realtà si è potuto osservare che le rotture non hanno una distribuzione casuale, ma si concentrano in alcune regioni.
 
I riarrangiamenti strutturali si dividono in due grandi gruppi : riarrangiamenti strutturali bilanciati e riarrangiamenti strutturali sbilanciati (sinonimi: anomalie bilanciate e anomalie sbilanciate). I primi non danno luogo nè a perdita nè ad acquisto di materiale genetico e le persone portatrici sono generalmente fenotipicamente normali. Possono essere ereditati per più generazioni senza che siano identificate. Quando ciò avviene è solitamente perchè i portatori possono essere infertili, oppure perchè nella loro storia riproduttiva si osserva abortività spontanea ripetuta o la nascita di un soggetto clinicamente affetto, che ha ereditato una forma sbilanciata del riarrangiamento.
 
Le anomalie sbilanciate provocano perdita/acquisto di materiale genetico, perciò vengono identificate  in soggetti con fenotipo clinico. I principali tipi di anomalie strutturali sono le delezioni, le duplicazioni, le inversioni, le traslocazioni, i cromosomi ad anello, gli isocromosomi.
 
Le delezioni consistono nella perdita di un segmento di un cromosoma, che può essere terminale o interstiziale. Nella tabella sottostante sono elencati alcuni esempi di sindromi causate da  delezione.
 

Sindrome

 

Regione che ha subito la delezione

Principali caratteristiche cliniche

Sindrome di Wolf-Hirschhorn

4p

dismorfismi facciali caratteristici, coloboma oculare, labiopalatoschisi, anomalie viscerali, grave ritardo psicomotorio

Sindrome del Cri du Chat

5p

microcefalia, ipertelorismo,micrognazia, grave ritardo mentale

Sindrome di Williams

7q11.23

ritardo mentale, bassa statura, stenosi aortica sopravalvolare, ipercalcemia

Sindrome di Jacobsen

11q24.1-qter

ritardo mentale e di crescita, trigonocefalia, strabismo, difetti cardiaci, trombocitopenia

Sindrome di Angelman

15q11-q13, sul cromosoma di origine materna

ritardo mentale, assenza del linguaggio,microcefalia, convulsioni

Sindrome di Prader-Willi

15q11-q13, sul cromosoma di origine paterna

bassa statura, ritardo mentale, obesità, ipogonadismo, dismorfismi facciali caratteristici, mani e piedi piccoli.

Sindrome di Miller-Dieker

17p13.3

ritardo mentale e di crescita, lissencefalia, microcefalia

Sindrome di Smith-Magenis

17p11.2

ritardo mentale, iperattività, disturbi del sonno, bassa statura, brachicefalia, prognatismo

Sindrome di DiGeorge

22q11.2

ipo-aplasia del timo e delle parotidi, cardiopatie tronco-conali, dismorfismi facciali caratteristici

Sindrome di Kallmann

Xp22.3

ipogonadismo ipogonadotropico, habitus eunucoide, anosmia,

Di solito le sindromi da delezione interessano segmenti relativamente grandi di cromosoma (> 5 Mb). Delezioni di queste dimensioni possono essere identificate con tecniche di citogenetica tradizionale ad alta risoluzione. Delezioni inferiori alle 4 Mb possono essere identificate solo con le più moderne tecniche di citogenetica molecolare (FISH).
 
Le duplicazioni consistono nella presenza di due copie di un segmento di cromosoma, e pertando costituiscono delle trisomie parziali. Sono più comuni delle delezioni in quanto gli effetti dei loro sblilanciamenti sono meglio tollerati, ma solo in rari casi sono state associate a sindromi cliniche definite (sindrome di Beckwith-Wiedemann, sindrome da duplicazione 3q26.3 che ha fenotipo simile alla Corneglia De Lange). In generale le conseguenze cliniche di una duplicazione sono il ritardo dell'accrescimento, sia pre- che postnatale, ritardo mentale, dismorfismi e malformazioni.
 
Le inversioni originano da 2 rotture che avvengono sullo stesso cromosoma e dalla successiva rotazione di 180° del segmento compreso tra i punti di rottura. Le inversioni producono un nuovo allineamento dei geni lungo l'asse di un cromosoma e di solito non si associano ad alterazioni cliniche. I portatori di inversione sono però a rischio riproduttivo, in quanto possono produrre gameti sbilanciati.
 
Le traslocazioni reciproche originano dalla rottura di due o, raramente, di più cromosomi e dallo scambio reciproco dei segmenti, senza perdita o acquisizione di materiale cromosomico. In questo caso si tratta di traslocazioni bilanciate, che hanno una frequenza di circa 1:1.000 nella popolazione generale. I portatori di traslocazioni bilanciate sono generalmente clinicamente normali, ma a rischio riproduttivo, perchè possono produrre gameti sbilanciati.
 
Le traslocazioni Robertsoniane  hanno una frequenza di 1:1.000 nella popolazione ed originano dalla fusione di due cromosomi acrocentrici, che si sono rotti al centromero od in prossimità di questo. I cromosomi che si originano da questo scambio sono uno dotato di uno o due centromeri ed uno acentrico (cioè senza centromero). Quest'ultimo è instabile e viene perso alla prima divisione cellulare. I portatori di traslocazioni Robertsoniane hanno di conseguenza 45 cromosomi e sono clinicamente normali. Sono anch'essi a rischio riproduttivo potendo produrre gameti sbilanciati.
 
I cromosomi ad anello, detti anche ring, sono originati dalla rottura di entrambe le braccia di un cromosoma, perdita delle regioni distali alle rotture e riunione delle due estremità in una struttura ad anello, appunto. I ring possono essere sovrannumerari, ed in tal caso il portatore avrà 47 cromosomi e sarà trisomico per le regioni comprese nel ring, oppure possono aver sostituito un cromosoma normale, ed in tal caso il portatore avrà 46 cromosomi ma sarà parzialmente monosomico, per la perdita delle regioni  distali alle rotture. Poichè il segmento di cromosoma deleto di solito contiene numerosi geni, le conseguenze cliniche sono generalmente gravi.
 
Gli isocromosomi possono avere uno o due centromeri, sono formati da braccia uguali e simmetriche, e implicano la delezione di un braccio del cromosoma da cui originano  e la dupplicazione dell'altro. Gli isocromosomi più comuni sono quelli dei cromosomi del sesso, in particolare l'isocromosoma per il braccio lungo del cromosoma X, associato alla sindrome di Turner.
 
Citogenetica delle anomalie cromosomiche costituzionali
 
Le caratteristiche della patologia cromosomica identificano una serie di situazioni cliniche in cui è raccomandata l'analisi del cariotipo:
→ per la conferma diagnostica di sindromi cromosomiche clinicamente accertate [il che consente inoltre di definirne il tipo citogenetico (es. trisomia libera vs. traslocazione), la sua prognosi (aneuploidia omogenea vs. mosaico) ed il rischio di ricorrenza della patologia nella famiglia];
→ per lo screening di portatori di aberrazioni cromosomiche strutturali, correlate al rischio di produrre gameti sbilanciati.
 
Esempi di sindromi dovute ad anomalie cromosomiche costituzionali, e quindi diagnosticabili con l’analisi citogenetica sia pre-natale che post-natale, sono la sindrome di Down, la sindrome di Edwards, la sindrome di Patau, la sindrome di Turner, la sindrome di Klinefelter.
 
Esistono poi situazioni di “rischio” per anomalie cromosomiche fetali, che rendono giustificata la richiesta di diagnosi cromosomiche prenatali.
 
Analisi del cariotipo costituzionale post-natale
 
Le principali indicazioni per l'analisi cromosomica in epoca post-natale sono:
→ quadri clinici suggestivi di patologia cromosomica (es. sindrome di Down);
→ presenza di due o più malformazioni congenite non sindromiche;
→ ritardo mentale non sindromico;
→ bassa statura non sindromica;
→ genitali esterni ambigui;
→ neonati nati morti con malformazioni o con causa non accertata;
→ genitori e familiari di pazienti con patologia cromosomica;
→ poliabortività;
→ infertilità primaria (es. maschi con oligospermia o azospermia, femmine con amenorrea primaria o secondaria);
→ controllo del cariotipo in coppie che si sottopongono a fecondazione assistita;
→ aborti spontanei (l'analisi del cariotipo su tessuto abortivo consente di inquadrare la natura dell'aborto e di identificare eventuali rischi di ricorrenza).
 
Le anomalie cromosomiche costituzionali si riscontrano nel:
→ 50% degli aborti spontanei;
→ 10-40% dei feti malformati e/o con ritardo di crescita;
→ 510% dei nati morti o delle morti perinatali;
→ 0.8% dei neonati;
→ 48% dei neonati con difetti congeniti gravi;
→ 12-33% dei soggetti con ritardo mentale;
→ 5% dei maschi infertili (nel 15% degli azoospermici);
→ 9% delle amenorree primarie (55% di quelle associate a bassa statura e 73% di quelle con fenotipo turneriano).
 
Il materiale per l'analisi può essere rappresentato da sangue periferico, biopsie cutanee, villi placentari e tessuti fetali.
 
Analisi del cariotipo costituzionale pre-natale
 
L'analisi citogenetica viene effettuata in questo caso durante il primo o il secondo trimestre di gravidanza e permette l'identificazione di eventuali aberrazioni cromosomiche fetali. La diagnosi prenatale del corredo cromosomico fetale è indicata quando il rischio di aneuploidie o di sbilanciamenti dei cromosomi è aumentato.
 
Le principali indicazioni per l'analisi cromosomica in epoca pre-natale sono:
→ età materna superiore a 35 anni;
→ genitori con precedente figlio affetto da aneuploidia;
→ genitori eterozigoti per anomalie cromosomiche bilanciate;
→ evidenza ecografica di malformazioni fetali;
→ alterazioni biochimiche nella madre nel II trimestre (triplo-test positivo).
 
La pregressa poliabortività di coppie con cariotipo normale, l'esposizione di un genitore ad agenti mutageni, nonché considerazioni di natura strettamente psicologica, sono altre indicazioni che indirizzano talvolta la gestante alla diagnosi citogenetica pre-natale. Il materiale per l'analisi può essere rappresentato da liquido amniotico, villi coriali, sangue fetale.
 
L'amniocentesi è la tecnica attraverso la quale si esegue, sotto controllo ecografico e per via transaddominale, il prelievo del liquido amniotico (LA). Il rischio di aborto legato all'invasività della tecnica è circa 0.5-1%.  Per eseguire lo studio del cariotipo fetale il periodo ottimale per il prelievo è attorno alla 16a settimana e la quantità di materiale necessaria all'analisi è di circa 15-20 ml. Dopo centrifugazione del campione si separa la parte corpuscolata del LA, che contiene le cellule (amniociti) derivate per desquamazione della membrana amniotica, della cute, delle mucose e dall'apparato renale del feto. Gli amniociti vitali possono essere coltivati in vitro e consentono di ottenere, in circa 8-10 giorni una popolazione di cellule in crescita adeguata per lo studio del cariotipo. La parte non corpuscolata del LA viene utilizzata per il dosaggio dell'-fetoproteina, che consente il monitoraggio dei difetti del tubo neurale.
 
Il prelievo dei villi coriali viene effettuato attorno alla 10a-11a settimana di gestazione, sotto controllo ecografico, mediante villocentesi per via transaddominale o transcervicale. Il rischio di aborto associato alla tecnica è di circa 2-3%, di poco superiore al rischio di aborto spontaneo nella stessa epoca gestazionale. Il materiale prelevato con questa tecnica può essere utilizzato direttamente per l'analisi cromosomica, in quanto le cellule del citotrofoblasto si dividono spontaneamente, ottenendo il risultato in circa 48 ore, e/o coltivato in vitro per circa 10-15 giorni. In quest'ultimo caso si analizzano le cellule fetali di origine mesenchimale. Il massimo valore informativo si ottiene integrando il risultato  dell'analisi ottenuto dopo analisi diretta e  dopo coltura a medio termine. La quantità di materiale necessaria all'allestimento delle colture con entrambe le tecniche è  10mg.
 
Il prelievo di sangue fetale si ottiene, sempre sotto controllo ecografico, mediante cordocentesi effettuata solitamente tra la 18a e la 20a settimana di gestazione, per puntura transaddominale del funicolo a livello dell'inserzione placentare. Il rischio di aborto a seguito del prelievo è circa 2%. La quantità di materiale necessaria per lo studio del cariotipo è di circa 0.5 -1 ml. Le applicazioni di questa tecnica di prelievo sono limitate allo studio del cariotipo fetale in tutti i casi in cui sia necessaria una diagnosi rapida (il risultato si ottiene in circa 48-72 ore) normalmente richiesta per verificare un risultato ambiguo ottenuto su LA.
 
Citogenetica delle anomalie cromosomiche acquisite
 
Mutagenesi
 
L'esposizione ad agenti mutageni può indurre mutazioni geniche e/o cromosomiche. Il danno è spesso dose-dipendente e varia in rapporto all'agente induttore ed alla risposta individuale. L'analisi citogenetica costituisce un parametro indiretto di valutazione delle mutazioni.
 
Le principali indicazioni per questo tipo di analisi sono costituite da:
→ esposizione ad agenti mutageni chimici (ad esempio agenti alchilanti, idrocarburi policiclici aromatici);
→ esposizione ad agenti mutageni  fisici (ad esempio radiazioni ionizzanti).
Il materiale per l'analisi è rappresentato dal sangue periferico.
 
Citogenetica oncologica
 
Le anomalie cromosomiche somatiche sono comunemente identificate nei tessuti tumorali e costituiscono marcatori utili nella diagnosi, nella formulazione di giudizi prognostici, nella scelta di protocolli di terapia e nel follow-up della malattia. L'analisi citogenetica di tumori solidi si delinea come un'indagine di supporto da affiancare sempre all'analisi istopatologica
 
Le principali indicazioni per questo tipo di analisi sono costituite da:
→ neoplasie ematologiche;
→ tumori solidi.
Il materiale per l'analisi è rappresentato da sangue midollare e da biopsie del tessuto tumorale.
 
Tecniche di base per l'analisi del cariotipo
 
Lo studio dei cromosomi attraverso le tecniche di citogenetica convenzionale richiede la disponibilità di cellule vive e capaci di dividersi. Le cellule più utili e facilmente reperibili sono i linfociti del sangue periferico. Si possono comunque ottenere preparati cromosomici da tutti i tessuti in divisione. Possono essere ottenuti ad esempio preparati cromosomici "diretti" da tessuti in attiva proliferazione, quali ad esempio midollo osseo, linfonodi, tumori solidi, villi coriali, o preparati cromosomici ottenuti dopo coltura a "medio-lungo termine" di fibroblasti o di amniociti (cellule del liquido amniotico). I linfociti del sangue periferico vengono indotti a dividersi con l'uso di sostanze stimolanti, normalmente PHA (fitoemoagglutinina) che è un mitogeno che stimola la trasformazione e divisione dei linfociti T.
 
La scelta del campione per l'analisi cromosomica dipende dalla indicazione per cui viene richiesta l'indagine e se richiesta per diagnosi prenatale o postnatale. L'allestimento delle colture, il loro mantenimento, la loro durata variano da tessuto a tessuto, in generale comunque i passaggi previsti sono simili.
 

Allestimento colture

Mantenimento delle colture

Allestimento preparati

Cellule vive

Sterilità

Arresto della divisione

Sterilità

37°C

Trattamento ipotonico

Terreno di coltura idoneo

pH  7.2-7.4

Fissaggio

 Mitogeni

Umidità 97% circa

Preparazione dei vetrini

Antibiotici

Durata: dipende dal tessuto

Colorazione/bandeggio

 
Prerequisito all'analisi cromosomica è come ricordato la disponibilità di cellule vive, pertanto la massima cura va prestata sia in fase di prelievo che in fase di conservazione e trasporto al laboratorio. E' fondamentale che i prelievi ed i contenitori siano sterili.
 
I terreni di coltura sono liquidi e  costituiti da una soluzione salina bilanciata a cui vengono aggiunti vari additivi tra cui sali, glucosio ed un sistema tampone per mantenere il pH adeguato. Molti terreni contengono un indicatore di pH, generalmente rosso fenolo. Ai terreni devono essere aggiunti additivi necessari alla crescita cellulare, quali ad esempio L-Glutammina, siero fetale bovino, antibiotici.
 
I mitogeni vengono introdotti nelle sole colture di cellule che non vanno incontro spontaneamente a divisione cellulare, come i linfociti del sangue periferico.
 
Le colture vengono allestite in contenitori sterili (capsule, T-flask), generalmente dopo centrifugazione del campione, rappresentato nella maggior parte dei casi da sospensioni cellulari (sangue, midollo, liquido amniotico). Per l'analisi citogenetica viene utilizzato il precipitato cellulare ed il surnatante viene scartato. Nel caso del liquido amniotico questo può essere usato per test biochimici. Se il tessuto di partenza è invece solido (biopsie, villi coriali) questo viene disgregato mediante trattamento meccanico e/o enzimatico. Una volta allestite, le colture devono essere lasciate crescere in incubatori che garantiscono il mantenimento di temperatura, umidità, pH ottimali. La durata delle colture dipende dal tessuto, in generale i linfociti vengono coltivati per 72 ore, gli amniociti per 7-10 giorni, i tessuti solidi anche per periodi superiori ai 10-15 giorni. le colture a medio-lungo termine esigono che il terreno di coltura venga sostituito periodicamente per assicurare la presenza degli elementi nutritivi. Le crescita cellulare viene controllata periodicamente, fino al raggiungimento del numero di cellule necessarie all'analisi. Possono allora essere allestiti i preparati cromosomici, procedura che prevede la raccolta delle cellule in divisione allo stadio di metafase, il trattamento ipotonico che consente la dispersione dei cromosomi, il fissaggio degli stessi, la distribuzione su vetrini da microscopio.
 
A questo punto possono essere effettuati la colorazione e l'esame microscopico dei cromosomi. Colorando i vetrini con il colorante fluorescente chinacrina (Quinacrine, da cui bande Q) si ottiene, lungo l'asse principale dei cromosomi, una sequenza di regioni a diversa fluorescenza dette bande cromosomiche, caratteristiche per ogni cromosoma e quindi utilizzate per la classificazione dei cromosomi stessi. Le bande riflettono il diverso grado di condensazione della cromatina. Le regioni Q positive sono ricche in basi A+T, mentre le negative sono ricche in basi C+G. Lo stesso bandeggio viene prodotto colorando con una soluzione di Giemsa vetrini precedentemente trattati con soluzioni saline (bandeggio G). Esistono più tecniche di colorazione differenziale, che possono venire usate specificatamente per la caratterizzazione di determinati riarrangiamenti cromosomici.  Il numero delle bande varia in rapporto al grado di condensazione dei cromosomi. Sulle metafasi è di circa 300-450 bande per set aploide, ma può aumentare fino a tre volte sui cromosomi ijn profase o prometafase. Questi preparati vengono definiti ad alta risoluzione e sono utili ad evidenziare anomalie fini di struttura, non riconosciute dalle tecniche tradizionali.
 
 
  Citogenetica molecolare (FISH)
 
 
La tecnica più moderna di analisi dei cromosomi è quella molecolare, definita FISH (Fluorescent In Situ Hybridization). Questa tecnica consente la localizzazione di una qualsiasi sequenza di DNA su preparati fissati di cromosomi, di nuclei interfasici e di sezioni di tessuto. Il suo potere di risoluzione è superiore alla citogenetica tradizionale e consente di classificare anomalie di numero o di struttura non definibili attraverso le tecniche di bandeggiamento e di identificare riarrangiamenti criptici, in particolare le microdelezioni (piccole perdite di materiale cromosomico non evidenziabili con tecniche di citogenetica tradizionale). Non si applica di routine per l'analisi del cariotipo, ma solo nei casi in cui un sospetto clinico oppure un sospetto emerso dalle indagini tradizionali suggerisca l'opportunità di un approfondimento.
 
Le principali indicazioni per questo tipo di analisi sono costituite dalla diagnosi citogenetica delle sindromi da microdelezione o da microduplicazione come la sindrome di Angelman, la sindrome del Cri-du-chat, la sindrome di Kallman, la sindrome di Di George, la sindrome di Miller-Dieker, la sindrome di Prader-Willi, la sindrome di Smith-Magenis, la sindrome di Williams, la sindrome di Wolf-Hirschhorn, ed ancora per:
→ la determinazione dell’origine di cromosomi marcatori e loro caratterizzazione;
→ la caratterizzazione di riarrangiamenti cromosomici complessi , sia bilanciati sia sbilanciati;
→ la più fine definizione dei punti di rottura in riarrangiamenti cromosomici complessi;
→ lo studio delle aneuploidie su nuclei interfasici in amniociti non coltivati, linfociti del sangue periferico o fetale.
 
Sono attualmente disponibili le seguenti sonde molecolari (frammenti di DNA a singola elica, marcato):
→ sonde molecolari alfoidi ed altre sequenze ripetute, per il riconoscimento specifico dei centromeri di singoli cromosomi;
→ sonde molecolari painting cromosoma specifiche, per il riconoscimento di un singolo cromosoma o di tratti appartenenti al singolo cromosoma;
→ sonde molecolari painting subcromosoma specifiche, per il riconoscimento di frammenti cromosomici appartenenti al braccio corto od al braccio lungo di un singolo cromosoma;
→ sonde molecolari a singola copia in cosmide, per indagini mirate al singolo gene o a sindromi definite;
→ sequenze genomiche in YAC (Yeast Artificial Chromosome) per zone specifiche del genoma umano;
→ sonde subtelomeriche telomero specifiche che, contenendo sequenze uniche prossimali ai telomeri, possono essere utilizzate  per il riconoscimento di riarrangiamenti cromosomici criptici, coinvolgenti tali regioni.
 
Tutte le sonde possono essere utilizzate singolarmente od in coibridazione, sia per diagnosi prenatali che postnatali. Il materiale per l'analisi è rappresentato dai preparati cromosomici ottenuti da colture di sangue periferico, villi coriali, liquido amniotico, sangue funicolare, sangue midollare, biopsie.
 
 
 
  Genetica molecolare
 
 
Le tecniche utilizzate e le strategie di analisi per lo studio delle diverse sindromi genetiche possono essere differenti. In ciascun caso viene comunque applicata la strategia diagnostica più efficace, tenendo conto anche dei risultati di eventuali indagini di citogenetica e/o genetica molecolare eseguite in precedenza.
 
I più frequenti difetti molecolari che costituiscono i meccanismi patogenetici delle sindromi con maggiore impatto sociale  sono:
→ mutazioni puntiformi della sequenza genica.
→ espansione di triplette nucleotidiche ripetute all’estremità  5’ e 3’ non tradotta del gene.
→ delezioni di varia estensione della sequenza genica.
→ alterazione del pattern di metilazione in geni la cui espressione è regolata dal meccanismo dell’imprinting.
 
Generalmente, tutti questi difetti molecolari danno luogo alla produzione di forme anomale del prodotto proteico o alla sua completa assenza.
 
Per ciascun difetto genetico sono qui indicate le sindromi più note da esso causate :
→ mutazioni puntiformi  (fibrosi cistica, talassemia, emocromatosi);
→ espansione di triplette nucleotidiche (sindrome di Martin Bell o dell'X fragile, Corea di Huntington, atassia spinocerebellare);
→ delezioni di varia estensione della sequenza genica (distrofia muscolare di Duchenne, microdelezioni del cromosoma Y);
→ alterazione del pattern di metilazione (sindrome di Angelman, sindrome di Prader-Willi, sindrome di Beckwith-Wiedemann, sindrome di Silver-Russell).
 
E’ importante sottolineare che l’identificazione del difetto genetico ha non solo un significato diagnostico, ma, in alcuni casi, anche preventivo perchè consente di confermare o escludere la condizione di portatore nei parenti dei soggetti affetti.
 
Bisogna tuttavia considerare che le alterazioni sopra riportate non consentono la diagnosi nel 100% dei pazienti perchè il difetto molecolare talvolta è diverso da quelli comunemente studiati.
 
Il materiale per l'analisi è rappresentato da DNA estratto da tessuti diversi quali sangue periferico, liquido amniotico, villi coriali, tessuti abortivi e tessuti solidi.
 
 
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Le aree specialistiche

Ultimo aggiornamento: 20 maggio 2019

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Bayes
 
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Wim P. Krijnen
Applied Statistics for Bioinformatics using R

 eGFR, riflessioni critiche  [b]

 eGFR, indagine in Piemonte  [b]

Le statistiche del sito

E ora che i test genetici sono alla portata di tutti?
Con meno di mille euro è possibile comprare un test genetico su Internet: si manda un piccolo campione di cellule e poi si aspetta la risposta. Ma... a che cosa serve la risposta? Un dossier di Marika De Acetis dall’Archivio storico del sito www.torinoscienza.it
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 Attualità in tema di eGFR:

Esercizi di statistica

I migliori libri del mese
 
  Giovanni Federspil
   Logica clinica. I principi del metodo in medicina.
McGraw-Hill, 2004, pp. 368
ISBN: 88 386 2984-6

Regressione lineare parametrica con quattro modelli inclusa la regressione di Deming

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Dennis A. Noe
The logic of Laboratory Medicine.
Atlante di virologia
Virus2
390.620  visitatori
da settembre 2008 a dicembre 2018

Gradi centigradi o gradi Celsius?

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M. Besozzi
Errori cognitivi, probabilità e decisioni mediche.
 
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ECPEDM
Atlante del protozoi
Atlante dei protozoi intestinali
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Statistica e New01grafica con R
Espressione dei risultati nel laboratorio di chimica clinica
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   NIST/SEMATECH   e-Handbook of Statistical Methods
Pathology outlines
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Atlante di anatomia del Gray
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Spurious correlations

Concetti, metodi e strumenti per una
pensierocritico70
buona informazione
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M. Vidali - M. Besozzi
Statistica con R
per il laboratorio
di analisi cliniche.
 
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SCR
I migliori libri del mese
 
Luigi Tesio
   I bravi e i buoni.
Perché la medicina clinica può essere una scienza.
Il Pensiero Scientifico Editore, 2015, pp. 216
 ISBN: 978-88-490-0538-7
Gli inganni della correlazione:
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